Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE, em inglês: High performance liquid chromatography, HPLC) é um método de separação de compostos químicos em solução. Tem sido amplamente utilizada como ferramenta em várias áreas da química e biologia.
A cromatografia liquida foi definida no início de 1900 pelo botânico russo Mikhail S. Tswett. Considerado o pai da cromatografia, Tswett publicou o primeiro artigo de cromatografia líquida, no qual ele descreveu a separação de compostos (pigmentos de folhas) extraídos de plantas, utilizando solvente em uma coluna empacotada com partículas de carbonato de cálcio. No período entre 1906 e 1952 houve alguns avanços importantes, como por exemplo o surgimento da técnica de cromatografia planar, onde um papel é usado como suporte. No entanto, em 1950 foi introduzido como alternativa a camada fina de sílica, que posteriormente ficou conhecida como cromatografia de camada delgada (CCD). O avanço da cromatografia em coluna foi por volta de 1940, onde Martin e Synge, ganhadores do prêmio Nobel, descreveram a descoberta da cromatografia líquida-líquida (ou partição). Com o passar do tempo, a cromatografia líquida foi se aperfeiçoando até chegar no que conhecemos hoje como cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) (JANDERA; HENZE, 2012; MILLER, 2005).
Princípios gerais da cromatografia
O princípio básico da cromatografia é a separação de misturas, no qual os componentes a serem separados são distribuídos entre duas fases, uma fase estacionária e uma fase móvel, como mostrado na figura 1.
Figura 1: Esquema simplificado de separação de duas misturas.
Entre os diferentes tipos de cromatografia, a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE, em inglês: High performance liquid chromatography, HPLC) tem sido amplamente utilizada como uma ferramenta na bioquímica e análise de separação, identificação e quantificação de compostos ativos (HAYES et al., 2014). Um esquema simplificado de CLAE está descrito na figura 2.
Figura 2: Esquema de um HPLC: a) Reservatório da fase móvel; b) Desgaseificador; c) Bomba; d) Injetor de amostra; e) Compartimento de colunas termostatizado; f) Coluna de separação; g) Detector; h) Processador de dados.
Os principais componentes da cromatografia líquida são: a bomba, que movimenta a fase móvel e a amostra através da coluna; uma coluna, que contêm a fase estacionária, geralmente formada por partículas de sílica, porosas, esféricas e diâmetro em torno de 35 μm, e um detector que mostra os tempos de retenção das moléculas, sendo que o tempo de retenção varia de acordo com as interações da amostra com as fases estacionária e móvel (MALVIYA et al., 2010).
Parâmetros cromatográficos
Tempo de retenção
O tempo de retenção (tR) é o tempo gasto por um componente desde a sua injeção até a sua detecção na saída do sistema. O tempo de retenção engloba todo o tempo que um componente fica no sistema cromatográfico, seja diluído na fase móvel, seja retido na fase estacionária. A Figura 3 ilustra um cromatograma típico. O tempo indicado no primeiro sinal do cromatograma indica o tempo gasto pelas moléculas da fase móvel para atravessar a coluna e atingir o detector. Esse tempo é chamado de tempo morto (tM), e normalmente é determinado por algum composto ou impureza presente na mistura em análise que não é retido pela fase estacionária. Para a determinação dos tempos de retenção corrigidos (t’R) é necessário conhecer o tempo morto, uma vez que a correção é feita simplesmente descontando o seu valor do valor do tempo de retenção (MEYER, 2010).
Figura 3: Cromatograma típico para cálculo de parâmetros cromatográficos.
Fator de retenção ou capacidade
O fator de retenção é a medida da capacidade da coluna em reter um componente da amostra, ou seja, é a medida de retenção na fase estacionária (MILLER, 2005). O fator de retenção é dada pela equação abaixo:
onde,
k= fator de capacidade
tR = tempo de retenção
tM = tempo morto
Coeficiente de separação ou seletividade
O coeficiente de separação (a) é calculado pela razão entre os fatores de capacidade (k’) de dois compostos que resultem em picos adjacentes no cromatograma (MILLER, 2005). Por definição a seletividade é sempre maior que 1, e pode ser calculada pela equação abaixo:
onde,
a = fator de capacidade
k’B = fator de capacidade do composto B
k’A = fator de capacidade do composto A
trB = tempo de retenção do composto B
trA = tempo de retenção do composto A
tm = tempo morto
Eficiência
Para estimar a eficiência de uma coluna cromatográfica podemos usar dois termos que estão relacionados entre si: o número de pratos teóricos (N) e a altura equivalente a um prato teórico (H ou HETP), que se relacionam pela equação a seguir:
onde,
L = o comprimento da coluna cromatográfica
A altura equivalente de um prato teórico é utilizada para comparar a eficiência entre colunas de diferentes comprimentos. Quanto menor a altura do prato teórico, maior será a eficiência da coluna (MEYER, 2010).
Resolução
Para determinar a resolução entre duas bandas, consideram-se as larguras das bandas assim como seus respectivos tempos de retenção, de acordo com a equação a seguir:
Embora os parâmetros de citados acima sejam importantes, a separação de substâncias não depende somente deles. O alargamento das bandas, assim como a eficiência e a seletividade influenciam em uma boa resolução. Pode-se resumir a resolução como um relação complexa entre a eficiência (N), seletividade (α) e a retenção (k) (MEYER, 2010):
Alargamento de banda
Uma baixa eficiência de separação pode ser explicada pelo alargamento da banda de um composto. Há muitas razões que contribuem para o alargamento da banda, os fatores intrínsecos podem ser explicados pela equação de Van Deemter.
onde,
A = difusão por turbilhonamento (difusão de eddy)
B = difusão longitudinal
C = desequilíbrio local ou resistência à transferência de massa
A equação de Van Deemter é a equação fundamental para a descrição da performance de uma coluna, e mostra a relação da altura equivalente de um prato teórico, com a velocidade da fase móvel, u.
A difusão por turbilhonamento (A) é consequência dos diversos caminhos que as moléculas da amostra podem percorrer através da coluna. A difusão de três moléculas são mostradas na figura 4. Todas as três começam na mesma posição inicial, mas elas tendem a seguir caminhos diferentes ao longo da coluna empacotada. Devido ao fluxo constante da fase móvel, as três moléculas chegam com tempos diferentes e consequentemente se separando. A molécula que pegou o caminho direto (molécula 3) termina na parte da frente da banda, por exemplo. Esse termo da equação pode ser minimizado usando-se colunas de tamanho reduzido, com diâmetros internos menores, com enchimentos eficientes e partículas uniformes.
Figura 4: Ilustração da difusão de eddy ou efeito dos caminhos múltiplos.
O termo B, difusão longitudinal, se refere a difusão do soluto na fase móvel. Se a amostra permanece por um determinado período dentro da coluna, ela tenderá a se difundir em todas as direções (é como se fosse um cubo de açúcar dissolvendo no café sem agitar) (figura 5). Uma forma de minimizar este efeito é empregando-se altas velocidades lineares de fase móvel.
Figura 5: Alargamento da banda por difusão longitudinal
A resistência à transferência de massa, termo C, se refere ao processo de movimentação da amostra dentro e fora da fase estacionária e da fase móvel. Conforme a transferência de massas for mais rápida, melhor é a eficiência. Este processo pode ser melhorado pelo uso de camada mais finas de fase estacionárias, partículas menores, fases móveis de baixa viscosidade, assim como altas temperaturas (MILLER, 2005; MEYER, 2010).
Detectores de HPLC
O detector cromatográfico é um dispositivo conectado logo após a coluna cromatográfica que quando em contato com os analitos presentes no eluente, emite sinais elétricos que são registrados na forma de picos. Através deste registro, podem-se obter dados qualitativos e quantitativos sobre os analitos presentes na amostra.
Existem vários tipos de detectores, sendo que a escolha dependerá fortemente das características químicas ou físicas das espécies a se detectar. Os detectores de HPLC devem possuir várias características, entre elas:
Alta sensibilidade, seletividade, linearidade (correspondente a aumento da concentração do analito), pouco sensível às variações de temperatura e fluxo, preciso e com reprodutibilidade. Assim, o detector ideal é aquele adequado ao seu sistema cromatográfico, a fase móvel (eluente) utilizada e principalmente as propriedades dos analitos alvos presentes na análise.
O primeiro detector considerado na cromatografia líquida foi o olho humano, que através dos experimentos clássicos utilizando uma coluna de vidro, permitiu-se separar os compostos de colorações diferentes. Os primeiros detectores comerciais utilizados em um sistema de HPLC foram os detectores de índice de refração e de condutividade, entretanto, com a introdução do detector de UV em técnicas de HPLC, ampliaram-se as possibilidades de uso da cromatografia líquida na química analítica.
Detectores de UV-visível
São os detectores mais utilizados em HPLC, pois apresentam o mais baixo custo, aceitam o uso de gradiente e geralmente não são afetados por pequenas mudanças de fluxo e temperatura. Ele consiste em um fotômetro que mede a absorção de luz dos compostos, em certo comprimento de onda, compreendido entre as regiões visível e ultravioleta.
O princípio da detecção por UV-vis pode ser definido através da concentração do analito relacionada à fração da luz transmitida pela célula do detector pela lei de Beer-Lambert, onde:
A = Log (I0 / I ) = b.c. ε
Onde:
A – Absorbância ;
I0 – Intensidade da incidência de luz;
ε – Absortividade molar da substância;
b -Comprimento do percurso da célula do detector (cm) ;
c- Concentração da amostra em mols/L.
A absorvidade molar para um grande número de compostos pode ser encontrado na literatura. A absorbância geralmente é proporcional à concentração da amostra.
A configuração de um detector de UV-vis de comprimento de onda fixo pode ser representada pela seguinte figura 1:
figura 1 – detector de UV-vis de comprimento de onda fixo
A lâmpada, também chamada de fonte luminosa, pode ser de tungstênio, deutério, mercúrio, zinco, cádmio, xenônio ou outros, que será aplicada de acordo com a configuração do detector e comprimento de onda desejado.
As configurações mais comuns dos detectores de UV-vis são: Detector de comprimento de onda fixo, detector de comprimento de onda variável e detector de rede de diodos (diode array). Este último permite determinar os espectros das substâncias presentes da amostra no eluente com diferentes comprimentos de onda durante a análise cromatográfica.
A detecção por UV-vis é geralmente aplicada em compostos cujas moléculas possuam algumas características para a absorção na região de UV-vis. Abaixo segue tabela com os grupos principais que compõe os analitos analisados:
| Tabela 1 – PRINCIPAIS GRUPOS QUE ABSORVEM NA REGIÃO DE UV-Vis |
| Ligação dupla adjacente a um átomo com um par de elétrons livres |
| Bromo, iodo ou enxofre |
| Grupo carbonila (C=O ) |
| Grupo nitro ( NO2 ) |
| Duas ligações duplas conjugadas |
| Anel aromático |
| Íons inorgânicos: Brometo,iodeto, nitrito, nitrato |
A intensidade da absorção da molécula dependerá dos grupos presentes e da influência que eles podem exercer sobre os outros grupos presentes.
Detector de Fluorescência
São sensíveis, seletivos e com alta especificidade entre os detectores de HPLC. A sensibilidade deste tipo de detector pode ser de 10 a 1000 vezes mais que os detectores de UV-vis. O funcionamento do detector de fluorescência consiste em uma lâmpada de excitação (de espectro de bandas ou contínuo) seguida por um filtro ou uma rede de difração, incidindo o feixe luminoso sobre a célula da amostra e excitando a mesma, originando a emissão de um feixe de luz ao retornar ao estado fundamental, o qual é em seguida dirigido a um filtro ou monocromador, que seleciona o comprimento de onda emitido, fazendo-o incidir no fotodetector. Aplica-se em análises de HPAs, aminoácidos, esteroides, vitaminas e aditivos, corantes alimentares.
Detector de índice de refração (RI – Refrative index)
Também chamado de refratômetro diferencial, é conhecido como detector universal por apresentarem resposta para qualquer espécie de amostra. A análise baseia-se na mudança do índice de refração do eluente por causa dos componentes da amostra. Quanto maior a diferença do índice de refração da fase móvel e o componente da amostra, mais intenso é o sinal. Há três tipos de sistema óptico utilizados nos detectores de índice de refração: Fresnel, Deflexão e interferômetro.
A figura 2 demostra a configuração típica de um detector de índice de refração.
figura 2 -configuração típica de um detector de índice de refração
Este detector possui as seguintes características:
– Versatilidade, pois detecta todos os solutos;
-Moderada sensibilidade, sendo o detector de UV 1000vezes mais sensíveis, assim não recomendável para análise de traços;
-Sensível a qualquer alteração de temperatura alterando a resposta do detector.
-Fácil de operar;
– Pouco recomendável realizar gradiente;
– Não é destrutivo.
Os detectores de índice de refração são empregados quando outros disponíveis não correspondem aos compostos de interesse e a sensibilidade não for muito importante, em separações preparativas e nas análises de macromoléculas em cromatografia de exclusão por tamanho.
Detector eletroquímico (amperométrico)
A detecção é feita através da oxidação ou redução de compostos em célula de fluxo a partir dos eletrodos de trabalho e de referência na presença de um potencial elétrico. Pode apresentar um limite de detecção extremamente baixo e muito utilizado em análises de traços de compostos orgânicos com grande seletividade.
Detector condutimétrico
Aplicado em cromatografia Iônica, estes detectores têm alta sensibilidade e seletividade. A medição é realizada através da medida da condutividade total (eluente e componentes da amostra) com uma célula contendo entre dois a seis eletrodos de Ag, Pt ou aço inoxidável. Em alguns métodos, pode ser necessário o supressor, um artificio utilizado para reduzir os interferentes da fase móvel na medição. O detector condutimétrico é utilizado principalmente para determinação de cátions, ânions, metais, sulfactantes e ácidos orgânicos.
Espectrômetro de massas
Introduzido inicialmente em sistemas de HPLC com métodos bioanalíticos na determinação de fármacos em plasma e urina, os detectores de espectrômetro de massa para HPLC são muito utilizados em pesquisas e desenvolvimento permitindo a informação estrutural de compostos e a identificação de componentes desconhecidos presentes em amostras através da determinação de massa, carga e estrutura proveniente da forma ionizada dos componentes . Possui alta sensibilidade e aplicável a diversos analitos. O avanço nas formas de nebulização para vaporização da amostra, minimizando os efeitos do eluente, permitiu uma ampla aplicação do espectrômetro de massas na cromatografia líquida, antes mais restrita a detecção por cromatografia gasosa para análise de compostos voláteis.
Os sistemas de HPLC-MS e HPLC- MS/ MS dispõe de dispositivos acoplados ao sistema para viabilizar a vaporização do eluente + compostos para pesquisa dos espectros/massa. Os mais comuns são ionização eletronebulização (ESI- electrospray ionization) e ionização química em pressão atmosférica (APCI – atmospheric pressure chemical ionization).
Além dos detectores citados, há muitos outros detectores para HPLC com diversas aplicações, específicos ou não, entre eles:
– Detectores de radiotividade;
– Detectores de quimioluminescência de nitrogênio;
– Detectores quirais;
– Detectores de espalhamento de luz (light-scattering).
